01明场（BF）

    明场成像是常用的显微镜观察方式，适用于观察生物样品和材料样品。当你次通过明场观察时，你可能会看到透射光下呈现紫色的洋葱表皮细胞，这在生物课上的是很平常的体验。

    此外，在生物研究中，常使用明场成像进行免疫组化染色。不同标记方式可以呈现不同颜色的样本，也可以利用抗体标记或染料显色来区分不同组分。

▲HE染色和TMA标本中的DAB染色

虽然明场成像方法简单有效且成本低，但由于其标记成分数量有限，因此应用范围相对较窄，并且对比度不太明显，难以判断阳性结果。

   观察不透明的材料样品时，反射光明场是常用的观察方式。这种方法通过直接照射光源于样品表面，样品表面的结构对光的反射和吸收程度不同，从而形成具有亮暗差异的图像，反映了样品表面的粗糙度和吸光情况。

02暗场（DF）

    暗场成像与明场成像相对应。在暗场成像中，我们并不能直接观察到照明光线，而是将光线斜射到标本的表面上。根据丁道尔（Tyndall）现象，微粒会对斜射光进行反射或衍射，从而增强了这些微小物体的可见性，使我们能够观察到它们。

    通过采用暗场成像技术，我们可以有效地突出微小物体的细节和特征，甚至在标本背景较为复杂或样本透明性较高的情况下，仍能够清晰地观察到它们。这种观察方式对于研究微生物、细胞结构以及其他需要突出微小物体的应用领域非常有价值。

    实现暗场成像的方法如下：首先，通过显微镜剖面图我们可以看到，聚光镜会以一个特定的高度角将光锥对准标本，这样部分光线就不会直接进入物镜。

    在暗场成像中，标本的光经过衍射、反射和折射等光学效应后，再次进入物镜。这些效应是由光学不连续物（如细胞膜、细胞核和内部细胞器）引起的。由于这些效应的存在，标本的光被散射和重定向，进入物镜。此时，标本表现为明亮的物体，而周围则是黑色背景。

    通过这种方式，暗场成像能够突出物体的轮廓和细节，使其更加清晰可见。

    总的来说，暗场成像适合观察微小粒子、细菌形态、细菌计数、透明标本等，并能够显示标本的细微结构。

    然而，暗场成像也存在一些限制。首先，物体散射的光会影响成像，降低对比度并使标本细节模糊。此外，标本中的灰尘和碎片也会对生成的图像产生影响。

    同时，对于较薄的贴壁细胞来说，信号通常较弱。而对于较厚的植物和动物组织，它们会将过多的光线重新定向到物镜内，从而降低成像的对比度。因此，暗场成像对标本的要求较高。

    材料样品的暗场结构与生物样品稍有差异（参考左下方图）。反射光暗场可以呈现样品表面的超微小结构，能够观察到0.004um以下的细节。然而，由于微小结构会导致光的散射或衍射，因此在暗场条件下无法进行准确测量，仅适合用于观察和定位一些微小结构和缺陷。此外，反射光暗场还可用于获取透明或半透明材料的颜色信息，例如 PCB 板上的绿色油漆、铁锈的色彩等。

03相差（PH）

    差显镜（相差显微镜）是一种常用的观察方法，特别适用于活细胞成像。在明场观察下，细胞轮廓通常不清晰，无法分辨其边界和内部结构。

    差显镜利用光程差（相位差）的技术，将光通过不同厚度的标本时产生的光程差转化为可见的明暗变化，从而使得标本的结构得以区分。这种技术利用了人眼无法感知的相位信息，提供了对细胞结构的更好观察。

    从原理图中可以看出，相差成像的关键在于确保聚光镜和相差物镜之间的相差环匹配。当观察或成像培养的活细胞时，相差成像是一种有效增强对比度的方法。然而，它通常会导致边缘特征周围出现光晕，这些光晕实际上是光学伪影，会降低边界细节的可见性。

    此方法在处理厚标本方面并不适用，因为一旦远离焦平面，相位会发生变化，导致图像细节的扭曲。此外，浮动的碎片和其他失焦物体可能会干扰贴壁细胞的成像。

    随着荧光技术的进展，相差成像方式和荧光成像虽可以同时进行，但相差环的存在会降低荧光透过率，对于弱荧光样品的成像并不有利。

04偏光（POL）

    偏光显微镜由于其高灵敏度，可用于对不同各向异性样品进行定性和定量研究。定性偏振光显微镜在实际应用中非常普遍，然而偏振光显微镜的定量方面主要应用于晶体学、矿物学、地质学和化学等领域。

    偏振光显微镜通过在聚光镜之前和物镜之后插入交叉偏振器件来实现。细胞内具有双折射特性的组分会旋转光的偏振平面，从而在深色背景上呈现出明亮的特征。

    在过去几年中，高灵敏度偏振光显微镜取得了稳定的进展，使得生物学家能够检测各向异性亚细胞组件的双折射特性。这种技术被应用于骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌以及毛发等的研究中。

    对于不透明的材料样品，也可以利用偏振光观察进行分析，但需要使用反射光偏光模式。这种方法可以用来分析材料的双折射性，并且结合特殊的制备样品技术，还可以区分材料中晶体颗粒的晶体取向。

05微分干涉(DIC)

    微分干涉（DIC）是七种观察方式中复杂的一种。其光路不仅包括偏振组件，还包括一组特制棱镜，用于放大样品厚度梯度和折射率微小差异。例如，由于细胞中水相和脂质相之间的折射率差异，DIC可以产生出色的对比度，尤其在显示脂质双层时。

    此外，对于较平坦的贴壁哺乳动物和植物细胞，包括细胞质膜、细胞核、液泡、线粒体和压力纤维等，这些细胞边界通常具有显著的梯度，非常适合进行DIC成像。

    在植物组织中，双折射的细胞壁可能会降低DIC的对比度，但仍然可以显示表皮细胞中的核膜、液泡膜、某些线粒体、叶绿体和凝聚的染色体等结构。与相差成像相比，DIC的成像效果能够避免细胞边缘的光晕现象。

    微分干涉成像可以给样品带来立体感，使观察效果更加直观。然而，微分干涉的光路配件较为复杂，调节难度也较大。另外，由于微分干涉是基于偏振光原理，对于高双折射样品或嵌入双折射材料的样品，并不适合进行微分干涉观察。这些样品可能会引起干涉图案的扭曲或干扰，从而影响成像质量。

    尽管微分干涉无法用于塑料皿内样品的观察，但是塑料皿非常适合进行细胞培养。通过蔡司独有的PlasDIC技术，我们可以在塑料皿中对活细胞进行微分干涉观察。

    材料样品方面，微分干涉（DIC）观察方式逐渐受到更多关注和欢迎。然而，对于那些具有多个方向结构的材料而言，DIC已经无法满足其观察需求。蔡司提出的圆微分干涉技术通过使用圆偏振光替代线偏振光，能够一次性成像样品上360度不同取向的结构，避免了繁琐的样品旋转过程。这种新技术极大地简化了观察过程，并提供了更全面的信息。

06霍夫曼调制相差（HMC）

    霍夫曼调制相差（HMC）利用斜入射光照射样本，通过折射和衍射现象，在物镜光密度梯度调节器的作用下产生不同阴影，从而在透明样本表面形成明暗对比，增强观察效果。

与其他技术相比，霍夫曼调制相差不会受到使用双折射材料的光路中的限制，因此在检查聚合材料容器中的样本时更为有用。

然而，该方法存在一个不利之处，即HMC会产生许多光学伪像，因此在贴壁细胞成像或在玻璃盖片上进行观察时，其效果可能不如相差或DIC技术。

这里补充一点，还有一种新开发的观察技术，可看作相差与倾斜单边照明的结合（类似于HMC），用于检查培养容器中的活细胞。

    斜射光照射标本时会发生折射和衍射现象，通过物镜相衬板的作用，产生不同的阴影效果，从而在透明标本表面形成明暗差异，增加观察对比度。

07荧光成像（FL）

    荧光成像在当前的科研中得到广泛应用。无论是荧光免疫组化染色、融合蛋白转基因表达还是荧光染料染色，这些方法对于蛋白质的定位和定量分析、细胞的动态变化以及组织结构的观察具有重要影响。荧光成像技术为我们提供了一种高度敏感且可视化的工具，使得我们能够深入研究蛋白质的共定位关系以及其在细胞和组织水平上的功能。

    荧光成像的原理基于荧光分子在吸收能量后从激发态跃迁回基态时释放出的荧光信号。这种激发状态可以通过不同种类的光源来实现，比如普通荧光显微镜所使用的金属卤化物灯、LED荧光灯，以及共聚焦显微镜和双光子显微镜所使用的激光等。当荧光分子受到合适波长的激发光照射后，它们吸收能量并被激发到高能态，然后在经过一段时间后返回基态，并释放出荧光信号。这些荧光信号可以被探测器捕获并转换为可视化的图像，以实现对样品中荧光标记物的定位和观察。

需要记住的是，不同的荧光成像方式适合不同的研究对象：

✓ 由于sCOMS相机的快速成像特点，在钙成像上普通荧光显微镜具有速度优势。

✓ 共聚焦的信噪比和分辨率特点适合多色高分辨高对比成像。

✓ 利用双光子光漂白少的特性，对活细胞或活体动物成像具有显著优势。

✓ 利用不同的染料和荧光蛋白特性，还可以进行更多更复杂的荧光成像实验。

    材料样品也具有自发荧光的特性，不像生物样品那样需要特定染料进行标记。这使得我们能够直接观察材料样品的多彩一面。例如，树脂材料、纤维等样品常常展示出自发荧光的特点。利用这种特性，我们可以在科研和生产中应用荧光成像技术对样品进行缺陷检测等操作，从而为质量控制和产品开发提供保障。荧光成像技术在材料科学领域的应用不仅丰富了我们对材料性质的理解，还推动了材料研究与生产的进展。